Viral Hastalıklarda Teşhis

Virolojik Teşhis Amacıyla Örnekleme

Canlı hayvanlardan temel olarak iki farklı amaçla kan örnekleri alınabilir. Birincisi; virus izolasyonu amacıyla hastalığın akut döneminde antikoagulan içeren (EDTA, heparin veya sodyum sitrat) tüplere kan örneği alınmalıdır. İkinci olarak serolojik çalışmalar için kullanılacaksa içinde antikoagulan madde bulunmayan tüplere kan alınmalıdır. Mukozal yüzeylerde örnek alma işlemi svap adı verilen ucunda emici pamuk veya benzeri bulunan çubuklar kullanılarak gerçekleştirilir. İdrar ve dışkı örnekleri doğrudan bu amaçla kullanılan kaplar içerisine aktarılmalıdır. Nekropsi sonrası alınacak doku örnekleri doğrudan steril örnek kabı içerisine veya %50 gliserinli -fosfat tamponlu su bulunan steril örnek kaplarına alınmalıdır.

Soğuk zincir ortamının sağlanması için buz aküleri veya buz torbaları örneğin konulduğu izolasyonlu taşıma kapları ile gerçekleştirilir. Kan örnekleri kesinlikle dondurulmamalıdır.

Örneklerin Testlerde Kullanılmak Üzere Hazırlanması

Organ ve Dışkı Örneklerinin Hazırlanması

Organ ve dışkı örnekleri antibiyotik içeren PBS veya hücre kültür vasatı içinde 1/10 oranında sulandırılır ve sıvı ile tamamen karışıncaya kadar elle veya vorteks yardımıyla çalkalanır. Elde edilen santrifüj edilir. Üst sıvı enjektöre çekilip enjektör filtreden geçirilerek içerik yeni steril tüpe aktarılır.

Doku örnekleri homojenizatör ile doğrudan parçalanarak veya havan içerisine steril kum ilave edilerek homojenize edilir.

Kan Örneklerinin Hazırlanması

Virus izolasyonu için Kullanılacak Kanın Hazırlanması (Lökosit Hazırlama)

Lökosit hazırlama işlemi antikoagulanlı tüplere alınmış kan örneklerinde gerçekleştirilebilir. Lökosit hazırlama PBS’le yıkama ve Ficoll solüsyonuyla olmak iki şekilde gerçekleştirilir

Serolojik Çalışmalarda Kullanılacak Kanın Hazırlanması

Serolojik çalışmalar için kan örnekleri içinde antikoagulan madde bulunmayan tüplere alınır. Pıhtılaşan kan örnekleri santrifüj edilir. Serum örnekleri daha sonra testlerde kullanılıncaya kadar derin dondurucuda muhafaza edilir.

Svap (Sürüntü) Örneklerinin Hazırlanması

Laboratuvara getirilen svap örnekleri vortekslenerek svaba bulaşmış olan virus partikellerinin sıvı içine geçmesi sağlanır. Sıvı içerik steril tüpe aktarılarak soğutmalı santrifüjde santrifüj edilir. Üst sıvı enjektöre çekilerek enjektör filtresi ile yeni tüpe aktarılır.

İnokulumun Bakteriyel Kontaminasyondan Arındırılması

İnokulum hazırlanması esnasında kullanılan PBS veya hücre kültür vasatı içine katılan penisilin/streptomisin/neomisin gibi antibakteriyel ve antifungal antibiyotiklerin kullanılması ve örneklerin 0,45 mikrometre por çaplı filtreden geçirilmesiyle kontaminasyon büyük oranda engellenmesi beklenir. Fakat kontaminasyonun gerçekleştiği örnekler 0,22 por çaplı filtre çaplı enjektör filtreden geçirilerek örneklerdeki kontaminasyon engellenmiş olur.

Virolojik Teşhis Yöntemleri

Viral Antijenlerin Belirlenmesine Yönelik İşlemler ve Testler

Viral Partikülün Belirlenmesi

Diğer mikroorganizmalardan farklı olarak virusler ışık mikroskobu ile görüntülenemeyecek kadar küçük yapılardır. Virus partikelleri ancak elektron mikroskobunda görüntülenebilir.

Virus İzolasyonu ve İdentifikasyonu

Virus izolasyonu çalışmalarında başta hücre kültürü sistemleri yanında embriyolu tavuk yumurtası ve deney hayvanları kullanılabilmektedir.

Şüpheli materyalden hazırlanan inokulumlar embriyolu tavuk yumurtasına veya deney hayvanlarına inoküle edilir.

Viral antijenlerin varlığı enfekte doku ve organlarda direkt olarak belirlenebildiği gibi inokule edilen hücre kültürü ortamında viral antijenlerin belirlenmesi şeklindede gerçekleştirilebilir.

ELISA (Enzyme -Linked Immunosorbent Assay)

ELISA, yüksek duyarlılık, uygulama kolaylığı, hızlı sonuç vermesi ve virus izolasyonuna ihtiyaç duymadan gerçekleştirilebilmesi gibi sebeplerle rutin viroloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılmaktadır.

İmmunoperoksidaz Tekniği

Bu yöntemde peroksidazla işaretli antikorlar kullanılır. Yöntem temel olarak enfekte dokulardan hazırlanan ince kesitlerde uygulanabileceği gibi enfekte hücre kültürlerde de uygulanılabilir.

İmmunofloresan Yöntemi

Bu yöntem immuno peroksidaz yöntemiyle benzer şekilde gerçekleştirilir. Farklı olarak bu yöntemle floresan ışıma veren boyalar işaretlenmiş konjugatlar kullanılır. Bu boyalar ultraviyole bir ışık kaynağından gelen farklı dalga boylarındaki ışıkla görünür hale gelmektedir.

Hemaglutinasyon Testi

Bazı zarflı viruslerin (orthomyxoviruslar ve paramyxoviruslar) dış kapsit proteini olan hemaglutinin adı verilen proteinin eritrositlerle bir araya gelerek bir ağ şeklinde kümeleşmesine ve çöktürmesine hamaglutinasyon adı verilir. Adenovirus, parvovirus ve reoviruslar zarfsız virus olmasına rağmen hemaglutinasyon aktivitesi gösterirler.

Viruse Özgü Antikorların Belirlenmesinde Kullanılan Serolojik Yöntemler

Nötralizasyon testi

Bir virusün enfeksiyon oluşturabilme yeteneğinin viruse özgü antikorlarla engellenmesine nötralizasyon adı verilir. Test virusün çoğalabildiği deney hayvanları, embriyolu tavuk yumurtası ve hücre kültürü gibi canlı ortamlarda gerçekleştirilebilir.